利用酶联免疫吸附法（ELISA）筛选产生杂交瘤的单克隆抗体（mAb）耗时且昂贵。生物传感和流式细胞术的结合代表了一种有前途的快速、高通量的筛选mAb克隆的方法。基于氧化石墨烯（GO）和含有硒蛋白K （SELENOK）抗原表位N-端部分的异硫氰酸荧光素（FITC）标记肽的组装，我们设计了一种新型的氧化石墨烯荧光生物传感器，用于筛选高亲和力单抗产生的杂交瘤。FITC标记的肽被强吸附在氧化石墨烯表面，有效地淬灭了FITC荧光。特异的SELENOK mAb与FITC-肽竞争性结合，导致FITC-肽从氧化石墨烯表面释放，荧光恢复。该传感器成功地用于检测SELENOK mAb，其检测限为0.25 U。此外，我们还利用该FITC-Peptide/GO生物传感器在单细胞水平上进行原位可视化和高通量筛选SELENOK mAb杂交瘤（SMAHs）。所提出的传感器简单，相对便宜，高度特异性，适用于细胞分选试验，并且证明了在其他单抗杂交瘤库的特异性筛选中，肽-抗体相互作用的有效使用。
 
 
 
流程图1. 基于FITC-肽/GO复合物的SELENOK mAb检测和mAb杂交瘤筛选的示意图。
 
 
图1. 基于FITC-肽/GO复合物检测SELENOK mAb可行性。样品的荧光发射光谱(A)和紫外-可见吸收光谱(B)。
 
 
 
图2. 反应物浓度对检测性能的影响。(A)在不同浓度的GO和FITC肽存在下，荧光强度发生变化。(B)FITC肽的荧光变化与GO浓度的关系。我们将添加GO后GO和FITC-肽复合物的荧光强度定义为F，然后，在存在SELENOK mAb的情况下，SELENOK/FITC-肽复合物的荧光强度定义为F1。
 
 
图3. SELENOK mAb检测条件的优化。测试了时间进程(A-B)、缓冲液(C-D)和pH范围(E-F ),以确定基于荧光实验的最佳条件。
 

图4. SELENOK mAb含量的荧光检测。(A)显示了不同浓度的SELENOK mAb的荧光信号响应。(B)确定了荧光增强和不同浓度的SELENOK mAb之间的关系。插图显示了分析对较低SELENOK mAb量的响应。
 
 
 
图5. SELENOK mAb的选择性。用各种物质处理后增强的荧光强度(ΔF):甘氨酸(0.2 mM)、谷氨酰胺(1 mM)、CaCl₂ (0.5 mM)、KCl (1 mM)、葡萄糖(10 mM)、BSA (2.5 μg/mL)、FBS (2.5 μg/mL)、β-肌动蛋白 mAb(2.5 μg/mL)、SELENOK mAb(20 U)。
 
 
图6. SMAH细胞成像。细胞成像实验的共聚焦激光荧光图像包括(A) SMAH细胞和(B)与28μM FITC肽孵育2小时的RPMI-8226细胞。(C) SMAH细胞用1 mM肽预处理1小时，然后与28μM FITC肽孵育另外2小时。(D) SMAH细胞和(E) RPMI-8226细胞在与28μM FITC肽孵育2小时后用GO处理10分钟。(F)不同条件下荧光强度的流式细胞仪数据显示类似的结果。
      
                
图7. 筛选产生高亲和力mAb的杂交瘤。(A)用于分离具有不同荧光强度的群体的分选细胞的流式细胞仪数据。(B)通过ELISA检测的在细胞上清液中制备的SELENOK mAb的OD450值。对细胞上清液的蛋白质印迹(C)和光密度分析(D)进行了SELENOK mAb水平的分析。
 
       相关研究成果由暨南大学生命科学技术学院生物技术系Jingru Wang等人于2024年发表在Sensors and Actuators: B. Chemical (https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.135575 )上。原文：Screening high affinity monoclonal antibody producing hybridomas using a graphene oxide-based fluorescence biosensor

转自《石墨烯研究》公众号